Diferența cheie - Northern vs Southern vs Western Blotting
Detectarea secvențelor specifice de ADN, ARN și proteine este esențială pentru diferite tipuri de studii în biologia moleculară. Electroforeza pe gel este o tehnică care separă ADN-ul, ARN-ul și proteinele în funcție de dimensiunile lor. Din profilurile de gel, secvența ADN specială, secvența ARN sau proteina sunt detectate prin tehnici speciale numite blot și hibridizare cu sonde marcate. Există trei tipuri diferite de metode de ștergere și anume sudul, nordul și vestul. Diferența esențială între blottingul nordic sudic și vestic constă în tipul moleculei pe care o detectează dintr-o probă. Southern blot este o metodă care detectează o secvență specifică de ADN dintr-o probă de ADN. Northern blot este o tehnică care detectează o secvență specifică de ARN dintr-o probă de ARN. Western blot este o metodă care detectează o proteină specifică dintr-o probă de proteine.
CUPRINS
1. Prezentare generală și diferența cheie
2. Ce este Southern Blotting
3. Ce este Northern Blotting
4. Ce este Western Blotting
5. Comparație side by side - Northern vs Southern vs Western Blotting
6. Rezumat
Ce este Southern Blotting?
Tehnica Southern blot a fost dezvoltată de EM Southern în 1975 pentru identificarea unei secvențe specifice de ADN dintr-o probă de ADN. Aceasta este prima tehnică de blotare introdusă în biologia moleculară. A permis detectarea genelor specifice din ADN, a fragmentelor specifice din ADN etc. Există mai multe etape implicate în tehnica Southern Blot. Sunt după cum urmează.
- ADN-ul este izolat din probă și digerat cu endonucleaze de restricție.
- Proba digerată este separată prin electroforeză pe gel de agaroză.
- Fragmentele de ADN din gel sunt denaturate în fire individuale prin utilizarea unei soluții alcaline.
- ADN-ul monocatenar este transferat la o membrană filtrantă de nitroceluloză prin transfer capilar.
- ADN-ul transferat este fixat pe membrană permanent.
- ADN-ul fix de pe membrană este hibridizat cu sonde marcate.
- ADN-ul nelegat este spălat de pe membrană prin spălare.
- Filmul cu raze X este expus la membrană și se prepară un autoradiograf.
Southern blot este aplicat pentru diferite aspecte ale biologiei moleculare. Este util în cartografierea RFLP, studii criminalistice, metilarea ADN-ului în expresia genelor, detectarea genelor mutante în tulburări genetice, amprentarea ADN-ului etc.
Figura 01: Tehnica Southern Blotting
Ce este Northern Blotting?
Northern blot este o metodă concepută pentru a detecta o secvență specifică de ARN sau o secvență de ARNm dintr-o probă pentru a studia expresia genei. Această tehnică a fost dezvoltată de Alwine, Kemp și Stark în 1979. Se deosebește de tehnicile de blotting de la sud și de western datorită mai multor etape. Cu toate acestea, această tehnică este, de asemenea, efectuată prin electroforeză pe gel, ștergere și hibridizare cu sonde și detectare specifice marcate. Tehnica Northern Blot se realizează după cum urmează.
- ARN-ul este extras din probă și separat prin electroforeză pe gel.
- ARN-ul este transferat din gel pe o membrană de șters și fixat.
- Membrana este tratată cu o sondă marcată preparată din ADNc sau ARN (sonda este complementară unei secvențe specifice din probă).
- Sonda este incubată cu membrana pentru a se lega cu o secvență specifică.
- Sondele nelegate sunt spălate.
- Fragmentele hibridizate sunt detectate de un autoradiograf.
Northern blotting este un instrument important în detectarea și cuantificarea ARNm hibridizat, studierea degradării ARN-ului, evaluarea timpului de înjumătățire al ARN-ului, detectarea îmbinării ARN-ului, studierea expresiei genelor etc.
Figura 02: Northern Blotting
Ce este Western Blotting?
Western blot este o metodă de detectare a unei proteine specifice dintr-un amestec de proteine prin utilizarea anticorpului marcat. Prin urmare, western blot este, de asemenea, cunoscut sub numele de imunoblot. Această tehnică a fost introdusă de Towbin și colab în 1979 și este acum efectuată în mod obișnuit în laboratoare pentru analiza proteinelor. Pașii sunt următorii.
- Proteinele sunt extrase din probă
- Proteinele sunt separate de dimensiunile lor folosind electroforeza pe gel de poliacrilamidă
- Moleculele separate sunt transferate într-o membrană PVDF sau membrană de nitroceluloză prin electroporare
- Membrana este blocată pentru legarea nespecifică cu anticorpii
- Proteinele transferate se leagă de anticorpul primar (anticorpi marcați cu enzime).
- Membrana este spălată pentru a îndepărta anticorpii primari legați nespecific
- Anticorpii legați sunt detectați prin adăugarea unui substrat și detectarea precipitatului colorat format
Western blot este util în detectarea anticorpilor anti-HIV într-o probă de ser uman. Western blot poate fi, de asemenea, utilizat ca test de confirmare a infecției cu hepatită B și test definitiv pentru boala vacii nebune.
Figura 03: Western Blotting
Care este diferența dintre Northern Southern și Western Blotting?
Difuzarea articolului din mijloc înainte de tabel
Northern vs Southern vs Western Blotting |
|
| Tipul moleculei detectate | |
| Northern Blotting | Northern blotting detectează o secvență specifică de ARN dintr-o probă de ARN. |
| Southern Blotting | Southern blotting detectează o secvență specifică de ADN dintr-o probă de ADN. |
| Western Blotting | Western blot detectează o proteină specifică dintr-o probă de proteine. |
| Tipul de gel | |
| Northern Blotting | Acesta folosește gel de agaroză / formaldehidă. |
| Southern Blotting | Aceasta folosește un gel de agaroză. |
| Western Blotting | Acesta folosește gel de poliacrilamidă. |
| Metoda Bloting | |
| Northern Blotting | Acesta este un transfer capilar. |
| Southern Blotting | Acesta este un transfer capilar. |
| Western Blotting | Acesta este un transfer electric. |
| Sonde utilizate | |
| Northern Blotting | Sonde ADNc sau ARN marcate radioactiv sau nonradioactiv. |
| Southern Blotting | Sondele ADN sunt marcate radioactiv sau neradioactiv. |
| Western Blotting | Anticorpii primari sunt folosiți ca sonde. |
| Sistem de detectare | |
| Northern Blotting | Acest lucru se face folosind un autoradiograf sau detectarea luminii sau a modificării culorii. |
| Southern Blotting | Acest lucru se face folosind un autoradiograf, detectarea luminii sau a modificării culorii. |
| Western Blotting | Acest lucru se face folosind detectarea luminii sau a schimbării culorii. |
Rezumat - Northern vs Southern vs Western Blotting
Blotarea este o tehnică specială dezvoltată pentru identificarea ADN-ului, ARN-ului sau proteinelor specifice din probe. Există trei proceduri separate de ștergere, și anume nordul, sudul și vestul, pentru a detecta un anumit tip de moleculă. Tehnica Northern blotting este concepută pentru a detecta o secvență specifică de ARN dintr-un amestec de ARN. Tehnica Southern blot permite detectarea unei secvențe specifice de ADN dintr-o probă de ADN, iar tehnica Western blot este dezvoltată pentru a identifica o proteină specifică dintr-un amestec de proteine.
