Diferența cheie - Microarray vs secvențierea ARN
Transcriptomul reprezintă întregul conținut de ARN prezent într-o celulă incluzând ARNm, ARNr, ARNt, ARN degradat și ARN nedegradat. Profilarea transcriptomului este un proces important pentru a înțelege informațiile despre celule. Există mai multe metode avansate pentru profilarea transcriptomului. Microarray și secvențierea ARN sunt două tipuri de tehnologii dezvoltate pentru a analiza transcriptomul. Diferența cheie între microarray și secvențierea ARN este că microarray-ul se bazează pe potențialul de hibridizare a sondelor marcate în prealabil cu secvențe de ADNc țintă în timp ce secvențierea ARN se bazează pe secvențierea directă a firelor de ADNc prin tehnici avansate de secvențiere, cum ar fi NGS. Microarray se realizează cu cunoștințele anterioare despre secvențe, iar secvențierea ARN se realizează fără cunoștințele anterioare despre secvențe.
CUPRINS
1. Prezentare generală și diferența cheie
2. Ce este Microarray
3. Ce este secvențierea ARN
4. Comparație side by side - Microarray vs RNA Sequencing
5. Rezumat
Ce este Microarray?
Microarray este o metodă robustă, fiabilă și cu randament ridicat, utilizată pentru profilarea transcriptomului de către oamenii de știință. Este cea mai populară abordare pentru analiza transcrierii. Este o metodă low-cost, care depinde de sondele de hibridizare.
Tehnica începe cu extragerea ARNm din probă și construirea bibliotecii ADNc din ARN total. Apoi se amestecă cu sonde predesemnate marcate fluorescent pe o suprafață solidă (matrice spot). Secvențele complementare hibridizează cu sondele marcate în microarray. Apoi microarray-ul este spălat și ecranat, iar imaginea este cuantificată. Datele colectate ar trebui analizate pentru a obține profilurile de expresie relative.
Se presupune că intensitatea sondelor microarray este proporțională cu cantitatea de transcrieri din eșantion. Cu toate acestea, acuratețea tehnicii depinde de sondele proiectate, de cunoașterea prealabilă a secvenței și de afinitatea sondelor pentru hibridizare. Prin urmare, tehnologia microarray are limitări. Tehnica microarray nu poate fi realizată cu transcrieri cu abundență redusă. Nu reușește să diferențieze izoformele și să identifice variantele genetice. Deoarece această metodă depinde de hibridizarea sondelor, unele probleme legate de hibridizare, cum ar fi hibridizarea încrucișată, hibridizarea nespecifică etc., apar în tehnica microarray.
Figura 01: Microarray
Ce este secvențierea ARN?
Secvențierea pistolelor ARN (ARN seq) este o tehnică de secvențiere a transcriptomului, dezvoltată recent. Este o metodă rapidă și cu randament ridicat de profilare a transcriptomului. Cuantifică direct expresia genelor și are ca rezultat o investigație profundă a transcriptomului. ARN seq nu depinde de sondele predesemnate sau de cunoștințele anterioare ale secvențelor. Prin urmare, metoda ARN seq are o sensibilitate și o capacitate ridicate de a detecta gene noi și variante genetice.
Metoda de secvențiere a ARN se realizează prin mai mulți pași. ARN-ul total al celulei trebuie izolat și fragmentat. Apoi, folosind transcriptaza inversă, trebuie pregătită o bibliotecă de ADNc. Fiecare catenă de ADNc trebuie legată cu adaptoare. Apoi fragmentele ligate trebuie amplificate și purificate. În cele din urmă utilizând o metodă NGS, trebuie efectuată secvențierea ADNc.
Figura 02: Secvențierea ARN
Care este diferența dintre microarray și secvențierea ARN?
Difuzarea articolului din mijloc înainte de tabel
Microarray vs RNA Sequencing |
|
| Microarray este o metodă robustă, fiabilă, cu randament ridicat. | Secvențierea ARN este o metodă precisă și cu randament ridicat. |
| Cost | |
| Aceasta este o metodă low-cost. | Aceasta este o metodă costisitoare. |
| Analiza unui număr mare de probe | |
| Acest lucru facilitează analiza simultană a unui număr mare de probe. | Acest lucru facilitează analiza unui număr mare de probe. |
| Analiza datelor | |
| Analiza datelor este complexă. | În această metodă sunt generate mai multe date; prin urmare, procesul este mai complex. |
| Cunoașterea prealabilă a secvențelor | |
| Această metodă se bazează pe sonde de hibridizare, deci este necesară cunoașterea prealabilă a secvențelor. | Această metodă nu depinde de cunoștințele secvenței anterioare. |
| Variații structurale și gene noi | |
| Această metodă nu poate detecta variații structurale și gene noi. | Această metodă poate detecta variații structurale, cum ar fi fuzionarea genelor, îmbinarea alternativă și gene noi. |
| Sensibilitate | |
| Acest lucru nu poate detecta diferențele în expresia izoformelor, astfel încât aceasta are o sensibilitate limitată. | Aceasta are o sensibilitate ridicată. |
| Rezultat | |
| Acest lucru poate duce doar la niveluri relative de expresie. Acest lucru nu oferă cuantificarea absolută a expresiei genelor. | Oferă niveluri de exprimare absolute și relative. |
| Reanaliza datelor | |
| Acest lucru trebuie reluat pentru a reanaliza. | Datele de secvențiere pot fi reanalizate. |
| Nevoia de personal și infrastructură specifice | |
| Infrastructura și personalul specific nu sunt necesare pentru microarray. | Infrastructura și personalul specific cerut de secvențierea ARN. |
| Probleme tehnice | |
| Tehnica microarray are probleme tehnice, cum ar fi hibridizarea încrucișată, hibridizarea nespecifică, rata limitată de detectare a sondelor individuale etc. | Tehnica ARN seq evită probleme tehnice, cum ar fi hibridizarea încrucișată, hibridizarea nespecifică, rata limitată de detectare a sondelor individuale etc. |
| Tendințe | |
| Aceasta este o metodă părtinitoare, deoarece depinde de hibridizare. | Bias este scăzut în comparație cu microarray. |
Rezumat - Microarray vs RNA Sequencing
Microarray și metodele de secvențiere a ARN sunt platforme cu randament ridicat dezvoltate pentru profilarea transcriptomului. Ambele metode produc rezultate care sunt foarte corelate cu profilurile de expresie genică. Cu toate acestea, secvențierea ARN are avantaje față de microarray pentru analiza expresiei genelor. Secvențierea ARN este o metodă mai sensibilă pentru detectarea transcrierilor cu abundență scăzută decât microarray. Secvențierea ARN permite, de asemenea, diferențierea între izoforme și identificarea variantelor genetice. Cu toate acestea, microarray-ul este alegerea comună a majorității cercetătorilor, deoarece secvențierea ARN este o tehnică nouă și costisitoare, cu provocări de stocare a datelor și analiză complexă a datelor.
