Diferența cheie - PCR Primers vs Sequencing Primers
Odată cu evoluțiile recente din domeniul biologiei moleculare, au fost dezvoltate diferite tehnici genetice care au făcut procesele de investigație ale diferitelor căi ale subiectului ușoare și precise. PCR și alte proceduri de secvențiere sunt două astfel de tehnici importante. Folosesc subcomponenți diferiți. Grundele sunt considerate subcomponenta majoră comună atât tehnicilor PCR, cât și tehnicilor de secvențiere. Primerii PCR sunt utilizați pentru amplificarea unei anumite secvențe de ADN, în timp ce primerii de secvențiere sunt utilizați în contextul secvențierii unui fragment de ADN cu intenția de a dezvălui ordinea specifică a secvenței nucleotidice. Aceasta este diferența cheie între primerii PCR și primerii de secvențiere.
CUPRINS
1. Prezentare generală și diferența cheie
2. Ce sunt grundele PCR
3. Ce sunt grundele de secvențiere
4. Asemănări între grundele PCR și grundele de secvențializare
5. Comparație cot la cot - grundele PCR vs grundele de secvențiere în formă tabelară
6. Rezumat
Ce sunt grundele PCR?
Reacția în lanț a polimerazei (PCR) este o tehnică genetică care este utilizată în domeniul biologiei moleculare pentru a amplifica un singur sau câteva copii ale unui anumit segment de ADN și pentru a obține multe milioane de copii identice. Într-o reacție PCR, se utilizează diferite componente, inclusiv primeri. Grundurile sunt fire scurte de ADN cu o lungime de nucleotidă de 18-25, făcându-le compatibile cu regiunea inițială și finală a fragmentelor de ADN care urmează să fie amplificate. Grundurile pot fi grund înainte și grund invers. Acești primeri se leagă de fragmentul de ADN în punctele specifice în care face ca ADN-polimeraza să se lege de primerul specific la locație și să inițieze sinteza noii catene de ADN.
Selectarea primerilor este un aspect important al procesului PCR. Selectarea lungimii grundului este importantă. Lungimea ideală ar fi de 18-25 nucleotide. Dacă lungimea este prea scurtă sau prea lungă, grundurile nu se vor lega de secvența ADN pentru a fi amplificate cu precizie. Grundele care au o lungime prea scurtă duc la recoacerea nespecifică a grundului în diferite locații ale secvenței ADN.
Figura 01: Primere PCR
Conținutul de guanină și citozină (GC) dintr-un primer bun ar trebui să fie în intervalul 40-60. Temperatura de recoacere a grundului și temperatura de topire sunt factori vitali în timpul PCR. Temperatura de topire trebuie calculată cu precizie, iar temperatura de recoacere a grundului trebuie să fie cu 5 0 C mai mică decât temperatura de topire. Temperatura de topire trebuie să fie de 60 ° C și 75 ° C. Temperaturile prea ridicate sau prea scăzute vor duce la o activitate mai puțin activă a ADN-polimerazei.
Ce sunt grundele de secvențiere?
Primerii de secvențiere sunt utilizați în contextul secvențierii unui fragment de ADN cu intenția de a-i dezvălui identitatea specifică. Pentru a obține rezultate bune de secvențiere sunt importanți primeri și șabloane de înaltă calitate. Astfel, atunci când sunt selectați primerii, aceștia ar trebui să fie unici pentru o anumită regiune în care dorim să secvenționăm. De asemenea, ar trebui să aibă o orientare corectă în care secvențele sunt de obicei generate de la capetele 3 'la 5' ale primerilor. Secvenței ar trebui să îi lipsească auto-hibridizarea nedorită, cum ar fi formarea buclelor de ac de păr. Nu ar trebui să conțină formarea consecutivă a bazelor de Guanine.
Temperatura de topire (Tm) a grundului trebuie să fie adecvată condițiilor secvențierii. Prin urmare, ar trebui să se situeze între 52 o C și 74 o C. Prepararea oligonucleotidelor pentru a fi utilizate ca primer trebuie purificată pentru a obține lungimea completă dorită a secvenței. Dacă oligonucleotidele conțin impurități, semnalizarea secvenței primerului va fi suprapusă din diferite situri de amorsare și, de asemenea, va scădea numărul de celule de bază.
Figura 02: Grunduri de secvențiere
Temperatura de topire a grundului (Tm) a unei oligonucleotide determină cât de puternice sunt hibridizate firele complementare de ADN între ele. Tm poate fi considerat un calcul termodinamic în cazul în care este dependent de ambele secvențe de ADN și de mai multe condiții, cum ar fi concentrația de sare. Tm este important în timpul PCR, unde o variantă numită secvențierea ciclului este utilizată pentru a produce un grup de fragmente terminate cu dideoxinucleotidă. Aici, grundul care este secvențiat va fi inițial recoacut alternativ, apoi extins și în cele din urmă denaturat pentru amplificare. Prin urmare, valoarea Tm ar trebui să fie între 52 o C și 74 oC. Oligonucleotidele sintetizate pot fi obținute din laboratoarele de sinteză ADN / ARN după alegere. Scara mică de sinteză utilizată pentru secvențierea ADN este de obicei de 50 nmol. De asemenea, cel mai important, primerii utilizați pentru secvențiere ar trebui purificați pentru a nu conține impurități care să împiedice reducerea calității.
Care sunt asemănările dintre grundele PCR și grundele de secvențiere?
- Ambele grunduri PCR și grundurile de secvențiere sunt grunduri care sunt utilizate în procesul de amplificare a unei secvențe de ADN vizate.
- Atât amorsele PCR, cât și amorsele de secvențiere sunt compuse din nucleotide.
- Atât grundurile PCR, cât și grundurile de secvențiere sunt oligomeri scurți.
Care este diferența dintre grundele PCR și grundele de secvențiere?
Difuzarea articolului din mijloc înainte de tabel
PCR Primers vs Sequencing Primers |
|
| Primerii PCR sunt șiruri de ADN scurte cu o lungime a secvenței de nucleotide de 18-25, făcându-le compatibile cu regiunea de început și de sfârșit a fragmentelor de ADN care urmează să fie amplificate. | Primerii de secvențiere sunt oligomeri scurți care sunt utilizați în contextul secvențierii unui fragment de ADN cu intenția de a dezvălui identitatea sa specifică. |
| Funcţie | |
| Primerii PCR sunt utilizați pentru amplificarea unei anumite secvențe de ADN. | Primerii de secvențiere sunt utilizați în contextul secvențierii unui fragment de ADN cu intenția de a dezvălui identitatea sa specifică. |
| Număr de grunduri necesare | |
| Două grunduri; un primer primer și unul primer invers sunt folosiți ca primer PCR. | Aveți nevoie de un singur grund ca grund de secvențiere. |
Rezumat - PCR Primers vs Sequencing Primers
Primerii de secvențiere sunt utilizați în contextul secvențierii unui fragment de ADN cu intenția de a-i dezvălui identitatea specifică. Un primer de secvențiere va fi suficient pentru a rula procesul. Pentru a obține rezultate bune de secvențiere, sunt importante primere și șabloane de înaltă calitate. Astfel, atunci când sunt selectați primerii, aceștia ar trebui să fie unici pentru o anumită regiune în care dorim să secvenționăm. PCR Primers sunt fire scurte de ADN cu o lungime de nucleotidă de 18-25 care este compatibilă cu regiunea de început și de sfârșit a fragmentelor de ADN care urmează să fie amplificate. Grundurile PCR pot fi grund înainte și grund invers. Conținutul de guanină și citozină (GC) dintr-un primer bun ar trebui să fie în intervalul 40-60. Temperatura de recoacere a grundului și temperatura de topire sunt aspecte vitale în timpul PCR. Aceasta este diferența dintre primerii PCR și primerii de secvențiere.
