Diferența cheie - Secvențierea PCR vs ADN
PCR și secvențierea ADN sunt două tehnici importante în biologia moleculară. Reacția în lanț a polimerazei (PCR) este procesul care creează un număr mare de copii ale unui fragment de ADN. Secvențierea ADN este tehnica care rezultă în ordinea precisă a nucleotidelor unui anumit fragment de ADN. Aceasta este diferența cheie între secvențierea PCR și ADN. PCR este una dintre etapele majore implicate în secvențierea ADN-ului.
CUPRINS
1. Prezentare generală și diferența cheie
2. Ce este PCR
3. Ce este secvențierea ADN
4. Comparație side by side - PCR vs secvențierea ADN
5. Rezumat
Ce este PCR?
Reacția în lanț a polimerazei (PCR) este o tehnică de amplificare a ADN-ului utilizată în biologia moleculară. Produce mii până la milioane de copii ale unui anumit fragment de ADN. Această metodă a fost dezvoltată de Kary Mullis în 1983. În această tehnică, fragmentul de ADN care urmează să fie amplificat servește drept șablon și enzima ADN polimerază adaugă nucleotide complementare primerului care este disponibil în amestecul PCR. La sfârșitul reacției PCR, sunt sintetizate multe copii ale ADN-ului probei.
Există diferite componente ale amestecului de PCR, incluzând ADN, ADN polimerază (Taq polimerază), primeri (primeri înainte și invers), nucleotide (blocuri de ADN) și un tampon. PCR se întâmplă în interiorul unei mașini PCR, iar amestecul corect de PCR trebuie încărcat în mașină, iar programul corect ar trebui să fie condus. Această tehnică permite producerea a mii până la milioane de copii ale unei anumite secțiuni de ADN dintr-o cantitate foarte mică de ADN.
Reacțiile PCR apar într-un mod ciclic pentru a produce cantitatea vizibilă de produse PCR pe un gel. Există trei etape majore implicate într-o reacție PCR și anume denaturarea, recoacerea grundului și extinderea catenei așa cum se arată în Figura 01. Aceste trei etape au loc la trei temperaturi diferite. ADN-ul există sub formă dublu catenară prin legături de hidrogen între bazele complementare. Înainte de implicare, ADN-ul dublu catenar trebuie separat unul de celălalt. Se face dând o temperatură ridicată. La o temperatură ridicată, ADN dublu catenar se denaturează în catene simple. Apoi, primerii ar trebui să se apropie de capetele flancante ale fragmentului specific sau ale genei ADN-ului. Primer este o bucată scurtă de ADN monocatenar care este complementară secvenței țintă. Primerii înainte și invers se recoac cu bazele complementare la capetele flancante ale eșantionului ADN denaturat la temperatura de recoacere. Grundurile trebuie să fie rezistente la căldură. Odată ce primerii se recocesc cu ADN-ul probei, enzima taq polimerază inițiază sinteza noilor fire prin adăugarea de nucleotide care sunt complementare ADN-ului țintă. Taq polimeraza este o enzimă stabilă la căldură izolată dintr-o bacterie termofilă numită Thermus aquaticus. Tamponul PCR menține condițiile optime pentru acțiunea taq polimerazei. Aceste trei etape ale reacțiilor PCR sunt repetate pentru a produce cantitatea necesară de produs PCR. După fiecare reacție PCR, numărul copiei ADN este dublat. Prin urmare, o amplificare exponențială poate fi observată în PCR. Produsele PCR pot fi observate folosind electroforeza pe gel și pot fi purificate pentru studii ulterioare.
Figura 01: Etape majore ale unei reacții PCR
PCR este un instrument valoros în cercetarea medicală și biologică. PCR are o valoare specială în știința criminalistică, deoarece poate amplifica ADN-ul pentru studii din probele minuscule de la criminali și poate crea profiluri de ADN criminalistic. PCR este utilizat pe scară largă în multe domenii ale biologiei moleculare, inclusiv genotiparea, clonarea genelor, detectarea mutațiilor, secvențierea ADN-ului, microarrays-urile ADN și testarea paternității etc.
Figura 02: Reacția în lanț a polimerazei
Ce este secvențierea ADN?
Secvențierea ADN este determinarea unui ordin precis al nucleotidelor - adenină, guanină, citozină și timină într-un anumit fragment de ADN. Informațiile genetice sunt stocate în secvențele ADN utilizând ordinea corectă a nucleotidelor. Prin urmare, găsirea ordinii precise a nucleotidelor într-un fragment de ADN este foarte importantă pentru a cunoaște structura și funcția genelor.
Protocolul de secvențiere a ADN implică diferite procese. Primul pas este izolarea ADN-ului interesat sau a ADN-ului genomic al unui organism. Folosind PCR (așa cum este descris mai sus), regiunea dorită a ADN-ului ar trebui amplificată. Produsul PCR amplificat trebuie separat prin electroforeză pe gel și purificat. Fragmentele amplificate sunt servite ca șabloane pentru secvențierea. Secvențierea se poate face fie urmând secvențierea Sanger sau metoda de secvențiere cu randament ridicat. Secvențierea Sanger necesită electroforeză capilară a fragmentelor de ADN rezultate. Determinarea ordinii nucleotidice corecte se poate face prin citirea manuală a autoradiografiilor sau prin utilizarea secvențierelor automate de ADN.
Secvențierea genelor a contribuit la proiectul genomului uman și a facilitat cartarea genomului uman în 2003. În criminalistică, secvențierea ADN a permis identificarea indivizilor care prezintă secvențe ADN unice și identifică infractorii. În medicină, secvențierea ADN poate fi utilizată pentru a detecta genele responsabile de boli genetice și alte boli, pentru a găsi gene cu defecte și pentru a le înlocui cu gene corecte. În agricultură, informațiile de secvențiere a ADN-ului unor microorganisme sunt utilizate pentru a produce culturi transgenice cu caracteristicile dorite din punct de vedere economic.
Figura 03: Secvențierea ADN-ului
Care este diferența dintre PCR și secvențierea ADN-ului?
Difuzarea articolului din mijloc înainte de tabel
PCR vs Secvențierea ADN-ului |
|
| Procesul PCR creează mii până la milioane de copii ale fragmentului de ADN interesat. | Secvențierea ADN este procesul de determinare a ordinii precise a nucleotidelor într-un anumit fragment de ADN. |
| Rezultat | |
| PCR creează mii până la milioane de copii ale unui anumit fragment de ADN | Acest lucru duce la ordinea corectă a bazelor într-un anumit fragment de ADN. |
| Implicarea ddNTP-urilor | |
| PCR nu necesită ddNTP-uri. Folosește dNTP-uri. | Secvențierea ADN necesită ddNTP-uri pentru a termina formarea catenelor. |
Rezumat - PCR vs secvențierea ADN
PCR și secvențierea ADN sunt instrumente foarte importante în multe domenii ale biologiei moleculare. Amplificarea fragmentelor de ADN se face prin tehnica PCR în timp ce ordinea corectă a nucleotidelor unui fragment de ADN este determinată de secvențierea ADN-ului. Aceasta este diferența dintre PCR și secvențierea ADN-ului.
