Key Difference - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Nucleotidele sunt unitățile structurale de bază și elementele de bază ale ADN-ului. Molecula de ADN este compusă dintr-un lanț polinucleotidic. Există patru nucleotide diferite găsite în ADN. Aceste nucleotide sunt compuse din patru baze azotate diferite numite A (adenină), G (guanină), C (citozină), T (timină). Ordinea nucleotidelor din molecula ADN are o mare importanță deoarece codifică o informație genetică importantă pentru creșterea și dezvoltarea organismelor. Secvențierea ADN se referă la procesul care determină secvența nucleotidică precisă a ADN-ului. Există diferite metode de secvențiere a ADN-ului. Secvențierea Maxam Gilbert și secvențierea ADN Sanger sunt două metode de secvențiere ADN care aparțin secvențierii de primă generație. Procedura de secvențiere Maxam Gilbert determină secvența de bază prin scindarea chimică a fragmentelor de ADN marcate la capătul 5 'preferențial la fiecare dintre cele patru nucleotide și electroforeză pe gel. Procedura de secvențiere Sanger determină secvența nucleotidică prin sintetizarea ADN monocatenar utilizând ADN polimerază și dideoxinucleotide și electroforeză pe gel. Aceasta este diferența cheie între Maxam Gilbert și Sanger Sequencing.
CUPRINS
1. Prezentare generală și diferența cheie
2. Ce este Maxam Gilbert
3. Ce este Sanger Sequencing
4. Comparație Side by Side - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
5. Rezumat
Ce este secvențierea Maxam Gilbert?
Secvențierea Maxam Gilbert, cunoscută și sub numele de metodă de secvențiere chimică, este o tehnică care a fost dezvoltată pentru a determina ordinea nucleotidelor din ADN. Această metodă a fost introdusă de Walter Gilbert și Alan Maxam în 1976 și a devenit populară, deoarece poate fi efectuată direct cu ADN purificat. Metoda Maxam Gilbert aparține primei generații de secvențiere ADN și a fost prima metodă de secvențiere utilizată pe scară largă de către oamenii de știință.
Principiul de bază al acestei metode constă în restricționarea fragmentelor de ADN marcate la capăt la baze specifice prin substanțe chimice și condiții specifice bazei și separarea fragmentelor marcate prin electroforeză așa cum se arată în figura 01. Fragmentele sunt separate în funcție de dimensiunile lor pe gel. Deoarece fragmentele sunt marcate, secvența moleculei de ADN poate fi ușor dedusă.
Metoda Maxam Gilbert utilizează substanțe chimice specifice bazei pentru a sparge ADN-ul la baze specifice. Două substanțe chimice obișnuite numite dimetil sulfat și hidrazină sunt utilizate pentru a ataca selectiv purinele și respectiv pirimidinele.
Metoda de secvențiere Maxam Gilbert se realizează prin mai mulți pași după cum urmează.
- Purificarea secvenței ADN utilizând endonucleaze de restricție
- Etichetarea capetelor fragmentelor de ADN prin adăugarea de fosfați radioactivi
- Purificarea fragmentelor marcate din fragmente nemarcate prin electroforeză pe gel
- Separarea ADN-ului marcat la capăt în patru tuburi și tratarea cu substanțe chimice specifice bazei separat
- Electroforeza conținutului fiecărui tub pe linii separate pe un gel și separarea fragmentelor în funcție de lungimea lor.
- Detectarea fragmentelor prin autoradiografie.
Figura 01: Secvențierea lui Maxam Gilbert
Ce este secvențierea Sanger?
Secvențierea Sanger este o metodă de secvențiere dezvoltată de Frederick Sanger și colegii săi în 1977 pentru a determina secvența de bază a unui fragment de ADN dat. Este, de asemenea, cunoscut sub numele de secvențiere de terminare a lanțului sau metodă de secvențiere Dideoxi. Această metodă funcționează pe principiul încorporării selective a dideoxinucleotidelor de terminare a lanțului (ddNTP), cum ar fi ddGTP, ddCTP, ddATP și ddTTP de către ADN polimerază în timpul sintezei ADN monocatenar pentru a termina formarea catenei. Dideoxinucleotidelor le lipsesc grupuri 3 'OH pentru formarea legăturilor fosfodiester cu nucleotidele adiacente. Prin urmare, formarea catenei se oprește odată ce un ddNTP este încorporat în catena nou formată în timpul secvențierii sanger.
În această metodă, patru reacții de sinteză ADN separate (PCR) sunt efectuate în patru tuburi separate cu un tip de ddNTP. Alte cerințe sunt, de asemenea, furnizate pentru tuburile pentru PCR, inclusiv primerii, dNTP-urile, Taq polimeraza, condiții specifice, etc. Patru reacții separate sunt efectuate în patru tuburi cu patru amestecuri. După reacțiile PCR, fragmentele de ADN rezultate sunt denaturate termic și separate prin electroforeză pe gel. Apoi fragmentele sunt vizualizate utilizând fie un primer marcat (radioactiv sau fluorescent), fie dNTP-uri așa cum se arată în figura 02.
Figura 02: Secvențierea Sanger
Care este diferența dintre Maxam Gilbert și Sanger Sequencing?
Difuzarea articolului din mijloc înainte de tabel
Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing |
|
| Secvențierea Maxam Gilbert este prima tehnică dezvoltată pentru secvențierea ADN-ului. | Metoda de secvențiere Sanger a fost introdusă după metoda de secvențiere Maxam Gilbert. |
| Utilizare | |
| Această metodă este rar utilizată. | Secvențierea Sanger este utilizată în mod obișnuit pentru secvențierea. |
| Utilizarea substanțelor chimice periculoase | |
| Folosește substanțe chimice periculoase. | Utilizarea substanțelor chimice periculoase este limitată în comparație cu metoda Maxam Gilbert. |
| Etichetare pentru detectare | |
| Această metodă utilizează P 32 radioactiv pentru marcarea capetelor fragmentelor de ADN. | Secvențierea Sanger utilizează ddNTP-uri marcate radioactiv sau fluorescent. |
Rezumat - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Secvențierea Maxam Gilbert și Sanger sunt două tipuri de tehnici de secvențiere a ADN care intră în secvențierea ADN-ului de prima generație. Secvențierea Maxam Gilbert este prima metodă introdusă pentru secvențierea ADN în 1976 și se realizează prin ruperea fragmentelor de ADN marcate la capăt de substanțe chimice specifice bazei. Prin urmare, este cunoscut sub numele de secvențiere chimică. Metoda de secvențiere Sanger a fost introdusă în 1977 și se bazează pe reacțiile de terminare a lanțului conduse de ddNTP. Metoda de secvențiere Sanger populară decât metoda Maxam Gilbert datorită mai multor dezavantaje ale metodei Maxam Gilbert, cum ar fi consumul excesiv de timp, utilizarea substanțelor chimice periculoase etc. Aceasta este diferența dintre secvențierea Maxam Gilbert și Sanger.
