Diferența cheie - Secvențierea NGS vs Sanger
Secvențierea următoarei generații (NGS) și secvențierea Sanger sunt două tipuri de tehnici de secvențiere a nucleotidelor dezvoltate de-a lungul timpului. Metoda Sanger Sequencing a fost utilizată pe scară largă de mulți ani, iar NGS a înlocuit-o recent datorită avantajelor sale. Diferența cheie între secvențierea NGS și Sanger este că NGS funcționează pe principiul secvențierii de milioane de secvențe simultan într-un mod rapid printr-un sistem de secvențiere, în timp ce secvențierea Sanger funcționează pe principiul terminării lanțului datorită încorporării selective a dideoxinucleotidelor de către enzima ADN polimerază. în timpul replicării ADN-ului și separării rezultate a fragmentelor prin electroforeză capilară.
CUPRINS
1. Prezentare generală și diferența cheie
2. Ce este secvențierea nucleotidică
3. Ce este NGS
4. Ce este secvențierea Sanger
5. Comparație side by side - NGS vs Sanger Sequencing
6. Rezumat
Ce este secvențierea nucleotidelor?
Informațiile genetice sunt stocate în secvențele de nucleotide ale ADN-ului sau ARN-ului unui organism. Procesul de determinare a ordinii corecte a nucleotidelor (folosind patru baze) într-un anumit fragment (într-o genă, grup de gene, cromozom și genom complet) este cunoscut sub numele de secvențierea nucleotidelor. Este foarte important în studiile genomice, studiile criminalistice, virologia, sistematica biologică, diagnosticul medical, biotehnologia și în multe alte domenii să se analizeze structura și funcția genelor. Există diferite tipuri de metode de secvențiere dezvoltate de oamenii de știință. Dintre acestea, secvențierea Sanger dezvoltată de Frederick Sanger în 1977 a fost folosită pe scară largă și popularizată pentru o perioadă lungă de timp până când secvențierea următoarei generații a înlocuit-o.
Ce este NGS?
Secvențierea următoarei generații (NGS) este un termen folosit pentru a se referi la procesele moderne de secvențiere cu randament ridicat. Descrie o serie de diferite tehnologii moderne de secvențiere care au revoluționat studiile genomice și biologia moleculară. Aceste tehnici sunt secvențierea Illumina, secvențierea Roche 454, secvențierea Ion Proton și secvențierea SOLiD (Sequencing by Oligo Ligation Detection). Sistemele NGS sunt mai rapide și mai ieftine. Patru metode principale de secvențiere a ADN-ului sunt utilizate în sistemele NGS și anume; piroza secvențierea, secvențierea prin sinteză, secvențierea prin ligare și secvențierea semiconductorilor ionici. Un număr mare de catene de ADN sau ARN (milioane de) pot fi secvențiate în paralel. Permite secvențierea întregului genom al organismelor într-o perioadă scurtă de timp, spre deosebire de secvențierea Sanger, care necesită mai mult timp.
NGS are multe avantaje față de metoda convențională Sanger de secvențiere. Este un proces de viteză mare, mai precis și mai rentabil, care poate fi realizat cu o dimensiune mică a eșantionului. NGS poate fi utilizat în studii metagenomice, în detectarea variațiilor dintr-un genom individual datorită inserțiilor și delețiilor etc. și în analiza expresiilor genetice.
Figura_1: Evoluții în secvențierea NGS
Ce este secvențierea Sanger?
Secvențierea Sanger este o metodă de secvențiere dezvoltată de Frederick Sanger și colegii săi în 1977 pentru a determina ordinea nucleotidică precisă a unui fragment de ADN dat. Este, de asemenea, cunoscut sub numele de secvențierea de terminare a lanțului sau secvențierea Dideoxi. Principiul de lucru al acestei metode este încetarea sintezei catenelor prin încorporarea selectivă a unui dideoxinucleotide de tip lanț (ddNTP), cum ar fi ddGTP, ddCTP, ddATP și ddTTP de ADN polimerază în timpul replicării ADN-ului. Nucleotidele normale au grupări 3 'OH pentru formarea unei legături fosfodiesterice între nucleotidele adiacente pentru a continua formarea catenei. Cu toate acestea, ddNTP-urilor le lipsește această grupare 3 'OH și sunt incapabile să formeze legături fosfodiesterice între nucleotide. Prin urmare, alungirea lanțului este încetată.
În această metodă, ADN-ul monocatenar care urmează să fie secvențiat servește drept șablon șablon pentru sinteza ADN-ului in vitro. Alte cerințe sunt primerul oligonucleotidic, precursorii deoxinucleotidelor și enzima ADN polimerază. Când sunt cunoscute capetele flancante ale fragmentului țintă, primerii pot fi proiectați cu ușurință pentru replicarea ADN-ului. Patru reacții de sinteză ADN separate sunt efectuate în patru tuburi separate. Fiecare tub are ddNTP-uri separate, împreună cu alte cerințe. Din nucleotida particulară, se adaugă un amestec de dNTP și ddNTP. La fel, patru reacții separate sunt efectuate în patru tuburi cu patru amestecuri. După reacții, se efectuează detectarea fragmentelor de ADN și conversia modelului fragmentului în informații de secvență. Fragmentele de ADN rezultate sunt denaturate termic și separate prin electroforeză pe gel. Dacă se utilizează nucleotide radioactive, modelul de bandă din gelul de poliacrilamidă poate fi vizualizat prin autoradiografie. Atunci când această metodă folosește dideoxinucleotidele marcate fluorescent, poate fi atenuată în josul gelului citit și trecut printr-un fascicul de laser pentru a fi detectat de detectorul fluorescent. Pentru a evita erorile care ar putea apărea atunci când o secvență este citită de ochi și intră manual într-un computer, această metodă s-a dezvoltat în utilizarea secvențierului automat cuplat cu computerul. Pentru a evita erorile care ar putea apărea atunci când o secvență este citită de ochi și intră manual într-un computer, această metodă s-a dezvoltat în utilizarea secvențierului automat cuplat cu computerul. Pentru a evita erorile care ar putea apărea atunci când o secvență este citită de ochi și intră manual într-un computer, această metodă s-a dezvoltat în utilizarea secvențierului automat cuplat cu computerul.
Aceasta este metoda utilizată pentru secvențierea ADN-ului din proiectul genomului uman. Această metodă este încă în uz cu modificări avansate, deoarece oferă informații precise despre secvență, în ciuda faptului că este un proces scump și lent.
Figura_2: Secvențierea Sanger
Care este diferența dintre NGS și Sanger Sequencing?
Difuzarea articolului din mijloc înainte de tabel
Secvențierea NGS vs Sanger |
|
| Secvențierea următoarei generații (NGS) se referă la procesele moderne de secvențiere cu randament ridicat. Descrie o serie de tehnologii moderne diferite de secvențiere | Secvențierea Sanger este o metodă de secvențiere dezvoltată de Frederick Sanger pentru a determina ordinea nucleotidică precisă a unui fragment de ADN dat. |
| Eficiența costurilor | |
| NGS este un proces mai ieftin, deoarece reduce timpul, puterea omului și substanțele chimice. | Acesta este un proces costisitor, deoarece necesită timp, putere omului și mai multe substanțe chimice. |
| Viteză | |
| Acest lucru este mai rapid, deoarece atât detectarea chimică, cât și detectarea semnalului pentru multe fire sunt paralele. | Acest lucru consumă mult timp, deoarece detectarea chimică și detectarea semnalului se întâmplă ca două procese separate și numai pe fir pot fi citite simultan. |
| Fiabilitate | |
| NGS este fiabil. | Secvențierea Sanger este mai puțin fiabilă |
| Marime de mostra | |
| NGS necesită o cantitate mai mică de ADN. | Această metodă are nevoie de o cantitate mare de șablon de ADN. |
| Bazele ADN pe fragment secvențiat | |
| Numărul de baze ADN per fragment secvențiat este mai mic decât metoda Sanger | Secvențele generatoare sunt mai lungi decât secvențele NGS. |
Rezumat - Secvențierea NGS vs Sanger
NGS și Sanger Sequencing sunt tehnici de secvențiere a nucleotidelor utilizate pe scară largă în biologia moleculară. Secvențierea Sanger este o metodă de secvențiere timpurie care a fost înlocuită cu NGS. Principala diferență între NGS și Sanger Sequencing este că NGS este un proces de viteză mare, mai precis și mai rentabil decât secvențierea Sanger. Ambele tehnici au creat focare majore în genetică și biotehnologie.
