Diferența cheie - Secvențierea Sanger vs Pirosequencing
Secvențierea ADN-ului este foarte importantă pentru analiza ADN, deoarece cunoașterea aranjamentului corect al nucleotidelor pe o anumită regiune ADN relevă multe informații importante despre aceasta. Există diferite metode de secvențiere a ADN-ului. Secvențierea Sanger și Pirosequencing sunt două metode diferite de secvențiere a ADN-ului utilizate pe scară largă în Biologia Moleculară. Diferența cheie între secvențierea Sanger și secvențierea pirozecvențială este că secvențializarea Sanger folosește dideoxinucleotide pentru a termina sinteza ADN-ului pentru a citi secvența nucleotidică în timp ce pirosecvențierea detectează eliberarea pirofosfatului prin încorporarea nucleotidelor și sintetizarea secvenței complementare pentru a citi ordinea exactă a secvenței.
CUPRINS
1. Prezentare generală și diferența cheie
2. Ce este secvențierea Sanger
3. Ce este pirosecvențierea
4. Comparație side by side - Secvențierea Sanger vs piroseșecarea
5. Rezumat
Ce este secvențierea Sanger?
Secvențierea Sanger este o metodă de secvențiere a ADN-ului de primă generație dezvoltată de Frederick Sanger și colegiile sale în 1977. Este cunoscută și sub denumirea Chain Termination Sequencing sau Dideoxy sequencing, deoarece se bazează pe terminarea lanțului de către dideoxinucleotide (ddNTPs). Această metodă a fost utilizată pe scară largă timp de mai bine de 30 de ani până când a fost dezvoltată secvențierea de nouă generație (NGS). Tehnica de secvențiere Sanger a permis descoperirea ordinii nucleotidice corecte sau atașarea unui anumit fragment de ADN. Se bazează pe încorporarea selectivă a ddNTP-urilor și încetarea sintezei ADN în timpul replicării ADN in vitro. Absența grupărilor 3 'OH pentru a continua formarea legăturii fosfodiesterice între nucleotidele adiacente este o caracteristică unică a ddNTP-urilor. Prin urmare, odată ce ddNTP este atașat, alungirea lanțului încetează și se termină din acel punct. Există patru ddNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP și ddTTP - utilizate în secvențierea Sanger. Aceste nucleotide opresc procesul de replicare a ADN-ului atunci când sunt încorporate în catena de ADN în creștere și au ca rezultat diferite lungimi de ADN scurt. Electroforeza pe gel capilar este utilizată pentru a organiza aceste fire scurte de ADN după mărimea lor pe un gel așa cum se arată în Figura 01.
Figura 1: Electroforeza pe gel capilar a ADN-ului scurt sintetizat
Pentru replicarea in vitro a ADN-ului, ar trebui furnizate puține cerințe. Acestea sunt enzima ADN polimerază, ADN șablon, primeri oligonucleotidici și deoxinucleotide (dNTP). În secvențierea Sanger, replicarea ADN-ului este efectuată în patru eprubete separate împreună cu patru tipuri de ddNTP-uri separat. Deoxinucleotidele nu sunt complet înlocuite de ddNTP-urile respective. Un amestec de dNTP special (de exemplu; dATP + ddATP) este inclus în tub și reprodus. Patru produse tubulare separate sunt rulate pe un gel în patru godeuri separate. Apoi, citind gelul, secvența poate fi construită așa cum se arată în Figura 02.
Figura 02: Secvențierea Sanger
Secvențierea Sanger este o tehnică importantă care ajută în multe domenii ale biologiei moleculare. Proiectul genomului uman a fost finalizat cu succes cu ajutorul metodelor bazate pe secvențierea Sanger. Secvențierea Sanger este, de asemenea, utilă în secvențierea ADN-ului țintă, cercetarea cancerului și a bolilor genetice, analiza expresiei genelor, identificarea umană, detectarea patogenilor, secvențierea microbiană etc.
Există mai multe dezavantaje ale secvențializării Sanger:
- Lungimea ADN-ului care este secvențiat nu poate depăși 1000 de perechi de baze
- Doar un fir poate fi secvențiat la un moment dat.
- Procesul este consumator de timp și costisitor.
Prin urmare, noi tehnici avansate de secvențiere au fost dezvoltate cu timpul pentru a depăși aceste probleme. Cu toate acestea, secvențierea Sanger este încă utilizată datorită rezultatelor sale foarte precise până la aproximativ 850 de fragmente de lungime a perechii de baze.
Ce este Pirosequencing?
Piroseqüențierea este o tehnică nouă de secvențiere a ADN bazată pe „secvențierea prin sinteză”. Această tehnică se bazează pe detectarea eliberării pirofosfatului la încorporarea nucleotidelor. Procesul este utilizat de patru enzime diferite: ADN polimer, ATP sulfurilază, luciferază și pirază și două substraturi adenozină 5 'fosfosulfat (APS) și luciferină.
Procesul începe cu legarea primerului cu șablonul de ADN monocatenar și ADN-polimeraza începe încorporarea nucleotidelor complementare acestuia. Când nucleotidele se unesc (polimerizarea acidului nucleic), eliberează grupuri și energie pirofosfat (două grupări fosfat legate împreună). Fiecare adăugare de nucleotide eliberează o cantitate echimolară de pirofosfat. Pirofosfatul se transformă în ATP prin ATP sulfurilază în prezența substratului APS. ATP generat determină conversia luciferazei mediată de luciferină în oxiluciferină, producând lumină vizibilă în cantități proporționale cu cantitatea de ATP. Lumina este detectată de un dispozitiv de detectare a fotonilor sau de un fotomultiplicator și creează o pirogramă. Apiraza degradează ATP și dNTP-urile necorporate în amestecul de reacție. Adăugarea dNTP se face o dată la rând. Deoarece adăugarea de nucleotide este cunoscută în funcție de încorporarea și detectarea luminii, se poate determina secvența șablonului. Pirograma este utilizată pentru generarea secvenței de nucleotide a probei de ADN așa cum se arată în Figura 03.
Piroza secvențierea este foarte importantă în analiza polimorfismului nucleotidic unic și secvențierea unor întinderi scurte de ADN. Precizia ridicată, flexibilitatea, ușurința automatizării și prelucrarea paralelă sunt avantajele pirozecvenței față de tehnicile de secvențiere Sanger.
Figura 03: Piroseqüențierea
Care este diferența dintre Sanger Sequencing și Pyrosequencing?
Difuzarea articolului din mijloc înainte de tabel
Sanger Sequencing vs Pyrosequencing |
|
| Secvențierea Sanger este o metodă de secvențiere a ADN bazată pe încorporarea selectivă a ddNTP-urilor prin ADN polimerază și terminarea lanțului. | Piroza secvențierea este o metodă de secvențiere a ADN bazată pe detectarea eliberării pirofosfatului la încorporarea nucleotidei. |
| Utilizarea ddNTP | |
| ddNTP-urile sunt utilizate pentru a termina replicarea ADN-ului | ddNTP-urile nu sunt utilizate. |
| Enzime implicate | |
| Se utilizează ADN polimeraza. | Se utilizează patru enzime: ADN polimerază, ATP sulfurilază, Luciferază și Apirază. |
| Substraturi utilizate | |
| APS și Luciferin nu sunt utilizate. | Se utilizează fosfosulfat de adenozină 5 '(APS) și luciferină. |
| Temperatura maximă | |
| Acesta este un proces lent. | Acesta este un proces rapid. |
Rezumat - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Secvențierea Sanger și Pirosequencing sunt două metode de secvențiere a ADN-ului utilizate în biologia moleculară. Secvențierea Sanger construiește ordinea nucleotidelor în ordine prin terminarea alungirii lanțului, în timp ce pirozecvența construiește ordinea precisă a nucleotidelor în ordine prin încorporarea nucleotidelor și detectarea eliberării pirofosfaților. Prin urmare, principala diferență între secvențierea Sanger și piroza secvențierea este că secvențierea Sanger funcționează pe secvențierea prin terminarea lanțului, în timp ce piroza secvențierea funcționează pe secvențierea prin sinteză.
